生化法 辅酶ⅠNAD(H)含量检测试剂盒 产品名称:辅酶ⅠNAD(H)含量检测试剂盒 微量法产品英文名: Micro NAD(H) Kit产品货号:BC0315 产地:北京市通州区马驹桥联东U谷8三楼产品规格:100管/48样 产品商标:solarbio 保存与运输:4℃保存或-20℃保存; 参考价格:1180 库存状态:现货 关键字:辅酶ⅠNAD(H)试剂盒|含量检测试剂盒|辅酶ⅠNAD(H)含量检测|微量法
简要介绍: 辅酶ⅠNAD(H)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,NAD+是糖酵解(EMP)和三羧酸循环(TCA)的主要氢受体,生成的NADH经呼吸电子链(ETC)传递把电子交给氧,在合成ATP的同时,形成大量的ROS,同时NADH再生为NAD+。糖、脂、蛋白质三大代谢物质分解中的氧化反应绝大部分通过这一体系完成。NAD(H)含量和NADH/NAD+比值的高低可用于评价糖酵解和TCA循环的强弱。较高的NAD(H)及NADH/NAD+比值说明细胞呼吸耗氧量较高,处于过氧化状态。此外,NADH/NAD+比值升高也可抑制糖酵解和TCA循环。另外,NAD+降解产物对细胞信号传导、代谢和基因表达等具有重要的调控作用。
产品详细描述 商品货号: | 商品品牌: | 规格 | 基本售价: | 选择规格 | BC0315-100管/48样 | Solarbio | 100管/48样 | 1180.00元 | |
产品内容: 酸性提取液:25mL×1 瓶,4℃保存; 碱性提取液:25mL×1 瓶,4℃保存; 试剂一:液体 5mL×1 瓶,4℃保存; 试剂二:液体 1.5mL×1 支,4℃保存 试剂三:粉剂×1 支,-20℃保存,用时加入 1.6mL 双蒸水,混匀,4℃保存一周; 试剂四:粉剂×1 支,4 ℃保存,用时加入 1.9mL 双蒸水,混匀,4℃保存一周; 试剂五:液体 0.7mL×1 支,4 ℃保存; 试剂六:液体 10mL×1 瓶,4 ℃保存; 试剂七:自备。19.2mL 乙醇和 0.8mL 蒸馏水充分混合备用。 NAD 标准品:粉剂×1 支,-20℃保存。临用前加入 1.5mL 蒸馏水,即 2umol/mL,将其稀释为 1.25nmol/mL 的 NAD 标准溶液备用。 NADH 标准品:粉剂×1 支,-20℃保存。临用前加入 1.4mL 蒸馏水,即 2umol/mL,将其稀释为 1.25nmol/mL 的 NADH 标准溶液备用。 操作步骤: 一、NAD+和 NADH 的提取: 1、血清(浆)中 NAD+和 NADH 的提取: NAD+的提取:取 0.1mL 血清(浆),加入 0.5mL 酸性提取液,煮沸 5min (盖紧,以防止水分 散失),冰浴冷却后,10000g 4℃离心 10min;取上清 200uL,加入等体积碱性提取液;混匀,10000g 4℃离心 10min,取上清,冰上保存待测。 NADH 的提取:取 0.1mL 血清(浆),加入 0.5mL 碱性提取液,煮沸 5min(盖紧,以防止水分 散失),冰浴冷却后,10000g 4℃离心 10min,取上清 200uL,加入等体积酸性提取液;混匀,10000g 4℃离心 10min,取上清,冰上保存待测。 2、组织中 NAD+和 NADH 的提取: NAD+的提取:称取约 0.1g 组织,加入 0.5mL 酸性提取液,冰浴研磨,煮沸 5min(盖紧,以防 止水分散失),冰浴冷却后,10000g 4℃离心 10min,取上清 200uL,加入等体积碱性提取液混匀, 10000g 4℃离心 10min,取上清,冰上保存待测。 NADH 的提取:称取约 0.1g 组织,加入 0.5mL 碱性提取液,冰浴研磨,煮沸 5min(盖紧,以防 止水分散失),冰浴冷却后,10000g 4℃离心 10min,取上清 200uL,加入等体积酸性提取液混匀, 10000g 4℃离心 10min,取上清,冰上保存待测。 3、细胞或细菌中 NAD+和 NADH 的提取: NAD+的提取:收集 500 万细胞或细菌,加入 0.5mL 酸性提取液,超声波破碎 1min(强度 20% 或 200W,超声 2s,停 1s),煮沸 5min(盖紧,以防止水分散失),冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心 10min,取上清液 200uL 另一新的离心管中,加入等体积的碱性提取液使之中和,混匀,10000g 4℃ 离心 10min,取上清,冰上保存待测。 NADH 的提取:收集 500 万细胞或细菌,加入 0.5mL 碱性提取液,超声波破碎 1min(强度 20% 或 200W,超声 2s,停 1s),煮沸 5min(盖紧,以防止水分散失),冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心 10min,取上清液 200uL 另一新的离心管中,加入等体积的酸性提取液使之中和,混匀,10000g 4℃ 离心 10min,取上清,冰上保存待测。
二、测定步骤: 1、可见分光光度计/酶标仪调节波长570nm,蒸馏水调零。 2、 操作表(在1.5ml棕色EP管中按下表依次加样)
试剂名称 | 对照管(µL) | 测定管(µL) | NAD 或 NADH 标准管 | 空白管 | 上清液 | 10 | 10 | | | 标准溶液 | | | 10 | | 蒸馏水 | | | | 10 | 试剂六 | 100 | | | | 试剂一 | 50 | 50 | 50 | 50 | 试剂二 | 15 | 15 | 15 | 15 | 试剂三 | 15 | 15 | 15 | 15 | 试剂四 | 15 | 15 | 15 | 15 | 试剂五 | 7 | 7 | 7 | 7 | 充分混匀,室温避光静置20min | 试剂六 | | 20 | 20 | 20 | 充分混匀,静置5min后,15000rpm,25℃离心15min,弃上清,沉淀中加入: | 试剂七 | 200 | 200 | 200 | 200 |
混匀, 570nm 下比色,读取吸光值ΔA 测定=A 测定管-A 对照管,NAD 标准管的记为ΔA 标准 1=A 标准管 1-A 空白管。 NADH 标准管的记为ΔA 标准 2=A 标准管 2-A 空白管。空白管只需做一 到两次。
注意事项: 1、操作过程应避光。不可将试剂一、二、三和四混合后再加,必须分开加。 2、反应过程要注意避光。 3、当吸光值大于 1 时,建议稀释后测量,计算公式中应当乘以稀释倍数。
NAD+含量的计算 - 血清(浆)中 NAD+含量计算
NAD+含量(nmol/mL)=ΔA 测定÷(ΔA 标准 1÷C 标)×V 提取÷V 血清=12.5×ΔA 测定÷ΔA 标准 1 2、组织、细菌、细胞中 NAD+含量计算 (1)按样本蛋白浓度计算 NAD+ (nmol/mg prot)=ΔA 测定÷(ΔA 标准 1÷C 标)×V 提取÷(V 提取×Cpr) = 1.25×ΔA 测定÷ΔA 标准 1 (2)按样本鲜重计算 NAD+ (nmol/g 鲜重)=ΔA 测定÷(ΔA 标准 1÷C 标)×V 提取÷W= 1.25×ΔA 测定÷ΔA 标准 1÷W (3)按细菌或细胞密度计算 NAD+ (nmol/10 4cell)=ΔA 测定÷(ΔA 标准 1÷C 标)×V 提取÷500=0.0025×ΔA 测定÷ΔA 标准 1
NADH 含量的计算 - 血清(浆)中 NADH 含量计算
NADH 含量(nmol/mL)=ΔA 测定÷(ΔA 标准 2÷C 标)×V 提取÷V 血清 =12.5×ΔA 测定÷ΔA 标准 2 2、组织中 NADH 含量计算 (1)按样本蛋白浓度计算 NADH (nmol/mg prot)=ΔA 测定÷(ΔA 标准 2÷C 标)×V 提取÷(V 样品×Cpr) = 1.25×ΔA 测定÷ΔA 标准 2 (2)按样本鲜重计算 NADH (nmol/g 鲜重)=ΔA 测定÷(ΔA 标准 2÷C 标)×V 提取÷W=1.25×ΔA 测定÷ΔA 标准 2÷W (3)按细菌或细胞密度计算 NADH (nmol/10 4cell)=ΔA 测定÷(ΔA 标准 2÷C 标)×V 提取÷500=0.0025×ΔA 测定÷ΔA 标准 2 C 标:NAD 或 NADH 标准溶液的浓度,1.25nmol/mL;V 提取:加入提取液总体积,1mL;V 血清:提取时加入的血清体积,0.1mL;W:样本鲜重,g;500:500 万个细胞。 生化法 辅酶ⅠNAD(H)含量检测试剂盒 |