产品名称:：线粒体呼吸链复合体Ⅴ活性检测试剂盒

产品英文名:  Mitochondrial Respiratory Chain ComplexⅤActivity Assay Kit

产品货号：BC1440               产地：北京市通州区马驹桥联东U谷8三楼

产品规格：50管/24样           产品商标：solarbio
保存与运输：4℃保存或-20℃保存；            参考价格：2600
库存状态：现货                          
关键字：：   ：  ：  线粒体呼吸链复合体Ⅴ检测试剂盒|  线粒体呼吸链复合体Ⅴ|线粒体呼吸链|试剂盒

简要介绍：
线粒体复合体Ⅴ又称F1F0-ATP合酶，广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，由F1和F0两个亚单位组成。该酶利用呼吸链产生的质子电化学梯度催化ATP合成，也可逆过程水解ATP。此外，复合体Ⅴ还存在于叶绿体、异养菌和光合细菌中。复合体Ⅴ是线粒体氧化磷酸化和叶绿体光合磷酸化合成ATP的关键酶。
    复合体Ⅴ水解ATP 产生ADP 和Pi，通过测定Pi 增加速率来测定复合体Ⅴ活性。


产品详细描述
产品内容：
提取液：液体15mL×1瓶，4℃保存；
试剂一：液体15mL×1瓶，4℃保存；
试剂二： 粉剂×1支，-20℃保存；临用前每支加入1.11mL双蒸水，充分溶解备用，分装后-20℃保存，避免反复冻融；
试剂三：液体6mL×1瓶，4℃保存；
试剂四：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入3mL双蒸水，充分混匀；
试剂五：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入10mL双蒸水，充分混匀；
试剂六：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入10mL双蒸水，充分混匀；
试剂七：液体10mL×1 瓶，室温保存。
标准品：液体1mL×1 支，4℃保存。10μmol/mL磷标准液。临用前用蒸馏水稀释40倍即0.25μmol/mL 磷标准液。
定磷试剂的配制：按H2O：试剂五：试剂六：试剂七=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷试剂应为浅黄色。若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染（请根据需要，用多少配多少）。
注意：配试剂用新的烧杯、玻璃棒和玻璃移液器，或者一次性塑料器皿，以避免磷污染。
 
产品说明：
线粒体复合体Ⅴ又称F₁F₀-ATP合酶，广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，由F1和F0两个亚单位组成。该酶利用呼吸链产生的质子电化学梯度催化ATP合成，也可逆过程水解ATP。此外，复合体Ⅴ还存在于叶绿体、异养菌和光合细菌中。复合体Ⅴ是线粒体氧化磷酸化和叶绿体光合磷酸化合成ATP的关键酶。
复合体Ⅴ水解ATP产生ADP和Pi，通过测定Pi增加速率来测定复合体Ⅴ活性。
试验中所需的仪器和试剂：
台式离心机、可见分光光度计、水浴锅、1mL玻璃比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、复合体Ⅴ的提取：   

• 称取约0.1g组织或收集500万细胞，加入1.0 mL提取液，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
• 4 ℃ 600 g离心10min。
• 将上清液移另一离心管中，4 ℃ 11000 g离心15min。
• 上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅳ（此步可选做，可以判断线粒体提取效果）。
• 在沉淀中加入400uL提取液，超声波破碎（功率20％，超声5秒，间隔10秒，重复15次），用于复合体Ⅳ酶活性测定，并且用于蛋白含量测定。

二、测定步骤：

1. 可见分光光度计预热30min以上，调节波长660nm，蒸馏水调零。
2. 操作表：

（1）酶促反应

（2）定磷

混匀，40℃水浴10min，尽快在660nm测定吸光值，分别记为A测定管、A对照管、A标准管，计算ΔA=A测定管-A对照管。

三、复合体Ⅴ活力单位的计算：
单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟产生1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。
复合体Ⅴ活性（U/mg prot）=ΔA÷A标准×C标准×V酶促×1000÷（Cpr×V样品）÷T
=20×ΔA÷A标准÷Cpr。
C标准液：标准溶液浓度，0.25μmol/mL； 1000：1μmol=1000nmol；Cpr：样品蛋白浓度，mg/mL，需自行测定，推荐我公司BCA蛋白浓度测定试剂盒；V样品：样品体积，0.2mL；V酶促，酶促反应总体积，0.48mL；T：反应时间，30min。
注意事项：

1. 为保证实验结果的准确性，需先取1-2个样做预实验，如果测定的吸光值过高（高于1），可用蒸馏水稀释上清液后再测定。计算结果时注意乘以稀释倍数。若ΔA大于0.4，需将样本稀释适当倍数（计算公式中乘以相应稀释倍数），使A1-A2 小于0.2，可提高检测灵敏度；若ΔA偏小，则可以通过增加加入的样品体积来提高灵敏度。
2. 由于提取液中含有蛋白，所以在测定样品蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量（单独测量）。
3. 本试剂盒试剂足够完成50管反应。
4. 附：使用样本重量计算公式：（检测样本数为50T/24S）

A、上清中复合体Ⅳ活力的计算：
按样本鲜重计算：
单位定义：每g组织在反应体系中每分钟催化降解1nmol还原型细胞色素C定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅳ活力(U/g)=[ΔA1×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(W÷V提取×V样)÷T=1099×ΔA1÷W
ΔA1：上清测定值；V 反总：反应体系总体积，8.4×10^-4 L；ε：细胞色素C摩尔消光系数，1.91×10⁴ L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.04 mL；V提取：加入提取液体积，1.0mL。 w：样本重量，g。T：反应时间，1 min；
B、沉淀中复合体Ⅳ活力的计算：
按样本鲜重计算：
单位定义：每g组织在反应体系中每分钟催化降解1nmol还原型细胞色素C定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅳ活力(U/g)=[ΔA2×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(W÷V提取×V样)÷T=440×ΔA2÷W
ΔA2：沉淀测定值；V 反总：反应体系总体积，8.4×10^-4 L；ε：细胞色素C摩尔消光系数，1.91×10⁴ L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.04 mL；V提取：加入提取液体积，0.4mL。 w：样本重量，g。T：反应时间，1 min；
C、样本复合体Ⅳ总活力的计算：
样本复合体Ⅳ总活力即为上清中复合体Ⅳ活力与沉淀中复合体Ⅳ活力之和。
按样本鲜重计算：
复合体Ⅳ（U/g）=1099×ΔA1÷W+440×ΔA2÷W

相关文献：
《A Damaged Oxidative Phosphorylation Mechanism Is Involved in the Antifungal Activity of Citral against Penicillium digitatum》 作者:Qiuli OuYang, Nengguo Tao* and Miaoling Zhang 期刊:Frontier in Immunology 影响因子:4.259 PMID:29503638
《Roles of TRPA1 and TRPV1 in cigarette smoke -induced airway epithelial cell injury model》 作者:Muyun Wang,Yanbei Zhang,Mengmeng Xu,HaiZhang,Yuqing Chen,Kian Fan Chung,Ian M.Adcock,Feng Li 期刊:Free Radic. Biol. Med. 影响因子:5.657 PMID:30639616


 

线粒体呼吸链复合体Ⅴ活性检测试剂盒