线粒体呼吸链复合体Ⅰ活性检测试剂盒

产品英文名:Micro Mitochondrial Respiratory Chain ComplexⅠActivity Assay Kit

产品货号：BC0515                产地：北京市通州区马驹桥联东U谷8三楼

产品规格：100管/96样            产品商标：solarbio
保存与运输：4℃保存或-20℃保存；            参考价格：2800
库存状态：现货                          
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简要介绍：
复合体Ⅰ（EC 1.6.5. 3）又称 NADH-CoQ 还原酶或 NADH 脱氢酶，广泛存在于动物、植物、 微生物和培养细胞的线粒体中，是线粒体内膜中大的蛋白复合物。该酶催化一对电子从 NADH 传递给 CoQ，同时可使O2还原生成 O2.-，是呼吸电子传递链上产生O2.-的主要部位。 测定该酶活性，不仅可以反映呼吸电子传递链（ETC）状态，而且可以反映活性氧（ROS） 生成状态。

产品详细描述
产品内容：
提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存；  
试剂一：液体20 mL×1瓶，4℃保存；
试剂二：粉剂×1支，4℃保存；临用前加入1mL丙tong。
试剂三：粉剂×1 支，-20℃保存；溶于1mL丙tong，可分装后-20℃保存。临用前再用丙tong100倍稀释后使用，现用现配。
试剂四：粉剂×1支，-20℃保存；临用前加入2mL蒸馏水，现配现用；   
工作液的配制：临用前将试剂二和试剂三1:1混合，现配现用。
产品说明：
复合体Ⅰ（EC 1.6.5. 3）又称NADH-CoQ 还原酶或NADH脱氢酶，广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，是线粒体内膜中大的蛋白复合物。该酶催化一对电子从NADH传递给CoQ，同时可使O₂还原生成O^2-，是呼吸电子传递链上产生O^2.-的主要部位。测定该酶活性，不仅可以反映呼吸电子传递链（ETC）状态，而且可以反映活性氧（ROS）生成状态。
复合体Ⅰ能够催化NADH脱氢生成NAD⁺，在340nm下测定NADH的氧化速率计算出该酶活性的大小。
试验中所需的仪器和试剂：
紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/石英96孔板 、研钵/匀浆器、丙tong、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、复合体的提取： 

1. 称取约0.1g组织或收集500万细胞，加入1.0 mL提取液，用匀浆器或研钵于冰上匀浆。
2. 4 ℃ 600 g离心10min。
3. 将上清液移另一离心管中，4 ℃ 11000 g离心15min。
4. 上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅰ（此步可选做，可以判断线粒体提取效果）。
5. 在沉淀中加入400μL提取液，超声波破碎（功率20％，超声5秒，间隔10秒，重复15次），用于复合体Ⅰ酶活性测定，并且用于蛋白含量测定。

二、测定步骤：

1. 紫外分光光度计预热30min 以上，调节波长340nm，蒸馏水调零。
2. 试剂一37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）预热15min。
3. 操作表：在微量石英比色皿/石英96孔板中分别加入

三、复合体Ⅰ活力单位的计算：  
（1）以微量石英比色皿计算：
单位定义：每mg 组织蛋白每分钟消耗1 nmol 的NADH 定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅰ活力（U/mg prot）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V 样×Cpr) ÷T =1608×ΔA÷Cpr
V 反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL； T：反应时间，2min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL。
（2）以96孔板计算：将上述公式中的d-1cm改为d-0.6cm进行计算即可。
注意事项：

1. 为保证实验结果的准确性，需先取1-2个样做预实验，如果测定的吸光值过高（高于1.5），可用蒸馏水稀释上清液后再测定。计算结果时注意乘以稀释倍数。若ΔA大于0.4，需将样本稀释适当倍数（计算公式中乘以相应稀释倍数）；若ΔA偏小，则可以通过增加加入的样品体积来提高灵敏度。
2. 样品蛋白浓度需自行测定，推荐我公司BCA蛋白浓度测定试剂盒。由于提取液中含有蛋白，所以在测定样品蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量。
3. 推荐使用样本蛋白浓度计算酶活，若用样本鲜重计算，则需加测胞浆提取物酶活，上清和沉淀酶活之和方为总酶活。
4. 本试剂盒试剂足够完成25管反应。
5. 附:使用样本重量计算公式：（样本检测数为25T/12S）

A、上清中复合体I活力的计算:
按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。
复合体I活性（U/g）= [ΔA1×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(W÷V提取×V样)÷T
                   =1608×ΔA1÷W。
ΔA1：上清测定值；V 反总：反应体系总体积，10^-3 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V提取：加入提取液体积，1mL ；V 样：加入样本体积，0.05mL；T：反应时间，2 min；W：样本重量，g。
B、沉淀中复合体I活力的计算:
按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。
复合体I活性（U/g）= [ΔA2×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(W÷V提取×V样本)）÷T
                   =643×ΔA2÷W。
ΔA2：沉淀测定值；V 反总：反应体系总体积，10^-3 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³ L / mol /cm d：比色皿光径，1cm；V提取：沉淀重悬体积，0.4mL ；V 样：加入样本体积，0.05mL；T：反应时间，2 min；W：样本重量，g。
C、样本复合体I总活力的计算:
样本复合体I总活力即为上清中复合体I活力与沉淀中复合体I活力之和。
按样本鲜重计算：
复合体I（U/g 鲜重）=1608×ΔA1÷W +643×ΔA2÷W。

相关文献：
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