一文读懂CCK-8试剂盒：检测原理、应用场景与注意事项

一文读懂CCK-8试剂盒：检测原理、应用场景与注意事项

一、产品概述  

CCK-8全称"细胞计数试剂盒-8"，是一种基于水溶性四唑盐WST-8（化学名2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐）的、广泛应用于细胞增殖与细胞毒性检测的快速、高灵敏度检测试剂盒。索莱宝"新型CCK-8试剂盒（货号CA1211）"在传统CCK-8（CA1210）基础上进一步优化，为即用型溶液，无需再行配制，可直接用于96孔板细胞实验，省略了细胞洗涤与收集等繁琐步骤，操作更简便、显色更稳定。它被普遍视为MTT法、XTT法、MTS法等传统四唑盐法的替代升级方案，目前在细胞生物学、药理学、肿瘤学、免疫学等研究领域已成为检测细胞活性与增殖抑制的主流手段之一。  

二、检测原理  

CCK-8的核心原理是"活细胞内脱氢酶还原四唑盐生成水溶性甲瓒"。具体而言：  

活细胞（尤其是线粒体中活跃的脱氢酶）能够将试剂盒中的WST-8试剂还原，生成一种橙黄色、高度水溶性的甲瓒（Formazan）产物。该甲瓒无需DMSO等有机溶剂溶解，可直接溶于培养体系，并且生成量与活细胞的数量及代谢活性成正比。因此，只需用酶标仪在450nm波长处测定体系的吸光度（OD值），即可间接、定量地反映活细胞的相对数量与增殖活力。  

这一原理决定了CCK-8的几个本质特征：第一，它检测的是具有代谢活性的活细胞，而非死细胞或总细胞；第二，显色强弱同时受"细胞数量"和"细胞代谢状态"两个因素影响，因此结果反映的是"增殖活力"或"毒性活力"，是一种功能性、相对量的指标；第三，由于依赖脱氢酶催化，凡能干扰氧化还原反应的物质（如还原剂、抗氧化剂）都可能对结果产生干扰。  

三、产品性能特点  

即用型设计，操作简便：试剂盒为即用型溶液，无需临用前配制，可直接向96孔板中加入，省去了MTT法中"加MTT—孵育—弃培养基—加DMSO溶解甲瓒"等多个步骤，也省去了细胞的洗涤与收集，显著缩短实验周期，降低人为操作误差。  

高灵敏度：相比传统MTT法，CCK-8的灵敏度更高，对少量细胞即可产生可检测的显色信号。当使用标准96孔板时，贴壁细胞的最小接种量可低至约1000个/孔（100µL培养基）即可被有效检测。  

产物水溶、无需溶解步骤：生成的甲瓒为水溶性，避免了MTT法生成的不溶性甲瓒结晶必须用DMSO/异丙醇溶解的麻烦，从而减少了因溶解不全、结晶分布不均造成的孔间误差。  

对细胞毒性低、可动态监测：CCK-8对细胞的毒性较低，在严格条件下甚至可对同一批细胞进行一定程度的连续监测，便于同一体系的动态观察。  

稳定性较好、显色可控：正常试剂应呈粉红色；显色后如暂时无法测定OD值，可向每孔加入10µL0.1MHCl或1%SDS（W/V）终止反应，加盖后于室温避光保存，24小时内吸光度基本保持稳定，为实验安排提供了灵活性。  

检测波长明确、兼容性好：在450nm处检测灵敏度最高；若无450nm滤光片，可使用430–490nm范围的滤光片；样品浑浊时可设定600–650nm作为参比波长扣除背景。培养基中酚红的本底吸光度可通过扣除空白孔消除，一般不影响检测。  
 

四、主要作用与应用场景  

细胞增殖检测：用于评估细胞因子、生长因子、激素等诱导的细胞增殖情况，绘制细胞生长曲线或增殖活力曲线。  

细胞毒性检测：用于抗癌药物、化学毒性物质、纳米材料、放射线等对细胞的毒性评价，是药物体外毒性筛选的常用手段。  

药物筛选与肿瘤药敏试验：通过不同浓度梯度药物处理，计算细胞存活率或抑制率，绘制剂量-效应曲线并推算IC50，为抗肿瘤药物敏感性评估、联合用药方案优化提供数据支撑。  

细胞生长抑制检测：用于评价某些药物或因素对细胞生长的抑制作用。  

标准曲线法定量细胞数量：在实验条件一致的前提下，可先以已知细胞浓度梯度做标准曲线（以细胞数量为横坐标、OD值为纵坐标），再据曲线推算未知样品的细胞数量。  

结果计算（常用公式）：  

细胞活力（存活率，%）＝[A(加药)−A(空白)]÷[A(对照，0加药)−A(空白)]×100  

抑制率（%）＝[A(对照)−A(实验)]÷[A(对照)−A(空白)]×100  

其中：A(加药/实验)为"含细胞＋药物＋CCK-8"孔的OD值；A(空白)为"仅培养基＋CCK-8、无细胞"孔的OD值；A(对照/0加药)为"含细胞＋CCK-8、不加药"孔的OD值。  

五、典型操作流程  

（一）细胞活性/增殖检测  

96孔板每孔接种细胞悬液100µL，于37℃、5%CO₂培养箱中预培养至贴壁（一般12–24h）。  

每孔加入10µLCCK-8溶液（终浓度约10%，按培养基总体积10%添加），避免产生气泡。  

放回培养箱37℃孵育1–4h（悬浮/白细胞可能需更长，可每0.5–1h观察显色，对照孔OD值控制在约0.8–1.0为宜）。  

酶标仪测定450nm处吸光度。  

若暂不测定，加10µL0.1MHCl或1%SDS终止，室温避光保存，24h内测定。  

（二）细胞增殖-毒性检测  

96孔板接种细胞100µL/孔，预培养约24h。  

加入10µL不同浓度待测药物，孵育一定时间（如6、12、24或48h）。  

每孔加10µLCCK-8（若待测物质具有氧化/还原性，建议先换液：弃培养基、用培养基洗涤细胞两次后加新鲜培养基，以排除药物干扰）。  

37℃孵育1–4h后测450nmOD值。  

需延后测定时同样用HCl/SDS终止并避光保存。  

分组设置建议：空白组（培养基＋CCK-8，无细胞）、对照组（细胞＋培养基＋CCK-8，无药物）、实验组（细胞＋药物＋CCK-8），每组至少3个复孔。  

六、使用注意事项  

试剂外观判断：本试剂正常颜色应为粉红色；若发现溶液变黄应弃用，说明试剂可能已失效或被污染。  

避免气泡：加CCK-8时切勿在孔中产生气泡，气泡会直接影响OD值读数；建议沿孔壁斜加，必要时用枪头戳破气泡。  

防蒸发：使用96孔板、培养时间较长时务必注意蒸发问题，96孔板最外圈最易蒸发，可弃用周围一圈，改加等量PBS、水或培养液以维持湿度环境。  

还原剂/抗氧化剂干扰：本检测依赖脱氢酶催化反应，体系中若含有较多还原剂、抗氧化剂，会直接还原WST-8造成假阳性，需设法去除或更换培养基；同样地，金属离子（如Pb²⁺、Fe²⁺、Cu²⁺）也可能干扰显色，应设置药物空白对照。  

待测物有颜色或有氧化还原性时：若待测物质本身有颜色或具氧化/还原性，应在加CCK-8前换新鲜培养基，或单独设置"药物＋CCK-8（无细胞）"对照扣除其本底。  

接种量与检测对象：贴壁细胞标准96孔板最小接种量建议≥1000个/孔；白细胞检测灵敏度相对较低，推荐接种量不低于2500个/孔，且白细胞孵育显色时间往往更长。若改用24孔板或6孔板，需相应换算每孔接种量，并按每孔培养基总体积的10%加入CCK-8。  

摸索预实验：建议先做几个孔预实验，摸索合适的接种细胞数量与加CCK-8后的孵育时间，使对照孔OD落在线性响应范围内（避免显色过强进入平台期或过弱低于检出限）。  

检测波长：优先450nm（灵敏度最高），无此滤光片时可用430–490nm替代；浑浊样品可加600–650nm参比波长扣背景。  

避光与防护：CCK-8试剂对光较敏感，操作与保存宜避光。本产品仅供科研使用，严禁用于医药、临床诊断或治疗、食品及化妆品等用途；请勿存放于普通住宅区。操作时应穿实验服、佩戴一次性手套和口罩，注意人身安全。  

保存条件：一般4℃密封避光保存（有效期视规格约数月至一年），如需长期保存可置于−20℃，但应避免反复冻融，以免降低试剂活性。