R8280 
rR8280 rProteinA/G Beads rProtein A/G 琼脂糖凝胶亲和层析介质

rProtein A/G Beads 是将rProteinA/G 高密度定向偶联到琼脂糖凝胶微球表面，该产品
具有更高的抗体结合能力和较低的蛋白非特异吸附率，洗脱条件更均一，一步纯化即可从血
清样品中分离出纯度大于90%的抗体。

++++=结合能力强；++=结合能力中等；—=结合能力弱或没有结合

纯化流程：
本产品分为两种应用：抗体纯化流程和免疫沉淀流程，免疫沉淀流程还分为直接法和间
接法。下面操作就从这三个方面详细介绍。
1、Buffer 的准备
所用水和Buffer在使用之前建议用0.22μm或0.45 μm滤膜过滤。
结合/ 洗杂Buffer： 0.15MNaCl，20 mMNa2HPO4，pH7.0
洗脱Buffer： 0.1M甘氨酸，pH3.0
中和液： 1MTris-HCl，pH8.5
交联Buffer： 0.2M三乙醇胺，pH8.2
终止液： 50 mMTris，pH7.5
2、样品准备
上柱之前要确保样品溶液有合适的离子强度和pH 值，可以用结合/洗杂缓冲液对血清样品、腹水或细胞培养液稀释，或者样品用结合/洗杂缓冲液透析。
样品在上样前建议离心或用 0.22μm或 0.45μm 滤膜过滤，减少杂质，提高蛋白纯化效率和防止堵塞柱子。
3、抗体纯化流程操作方法
抗体纯化流程示意图如:

1)将 rProtein A/G Beads 装入合适的层析柱，层析用 5 倍柱体积的结合Buffer 进行平衡，使填料处于与目的蛋白相同的缓冲体系下，起到保护蛋白的作用。
2)将样品加到平衡好的 rProtein A/G Beads 中（保证目的蛋白与 rProtein A Beads 充分接触，提高目的蛋白的回收率），收集流出液。
3)用10-15倍柱体积的洗杂Buffer进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗杂液。
4)使用5-10倍柱体积的洗脱Buffer，收集洗脱液，即目的蛋白组分。
5)依次使用3倍柱体积的结合Buffer和5倍柱体积的去离子水平衡填料，后再用5倍柱体积的20%的乙醇平衡，然后保存在等体积的20%的乙醇中，置于4 度保存，防止填料被细菌污染。
6)SDS-PAGE检测将使用纯化产品得到的样品（包括流出组分、洗杂组分和洗脱组分）以及原始样品使用SDS-PAGE 检测纯化效果。
4、 免疫沉淀直接法操作流程
免疫沉淀直接法操作流程示意图如下：4.1 抗体吸附
1）取适量的 rProtein A/G Beads 加入到2ml离心管中，500转离心1min，吸弃上清。
2)加入0.5ml结合Buffer，悬浮填料（使填料处于与目的蛋白相同的缓冲体系下，起到保护
蛋白的作用），500 转离心1min，吸弃上清。再重复两次。
3)向步骤2)平衡的填料中加入抗体溶液，悬浮填料，室温下置于翻转混合仪或者手工轻轻
翻转离心管，约30min 后，500 转离心1min，收集上清液，留待检测。
4)向3)的填料中加入0.5ml的洗杂Buffer，悬浮填料，进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，500 转离心1min，吸弃上清。再重复两次。
4.2 抗体交联 (备选)
如果需要将抗体和目标抗原复合物共同洗脱，请忽略本步骤，直接进行4.3。
1) 向清洗过的填料中加入1ml 交联Buffer，500 转离心1min，吸弃上清。
2) 再向其中加入1ml20 mMDMP（dimetylpimelimidatedihydrochloride）的交联Buffer，此试剂需要现用现配，悬浮填料，在室温下置于翻转混合仪或者手工轻轻翻转离心管，促使Buffer 和填料充分接触，约30min 后，500 转离心1min，吸弃上清。
3) 再向其中加入1ml 终止液，悬浮填料，终止交联反应，在室温下置于翻转混合仪或者手工轻轻翻转离心管，约15min 后，500 转离心1min，再吸弃上清。
4)加入0.5ml的洗杂Buffer，悬浮填料，进行清洗，500转离心1min，吸弃上清。再重复两次。
4.3 抗原沉淀反应
1)抗原吸附：加入含有抗原的样品，用移液器轻轻吹打使抗原与填料-抗体复合物均匀分散。
在室温下置于翻转混合仪或者手工轻轻翻转离心管10min，使抗原与抗体充分结合，如结合力较弱则可在室温下反应1h 或者在4℃下反应过ye。
2)洗杂：将上述完成抗原吸附的填料-抗体-抗原复合物进行离心，500 转离心 1min，收集上清液，置于冰上以备后续检测。向离心管中加入 1ml洗杂 Buffer，用移液器轻轻吹打使填料-抗体-抗原复合物均匀分散，然后进行离心分离，500 转离心1min，弃上清液。再重复洗涤两次。后加入 1ml洗杂液，用移液器将填料-抗体-抗原复合物悬液转移新的1.5 ml离心管中，并进行离心分离，500转离心1min，弃上清液。
3)抗原洗脱：提供以下两种抗原洗脱方案，可根据后期检测的需要选择不同的抗原洗脱方法。
变性洗脱法： 此方法洗脱的样品适用于SDS-PAGE 检测。向离心管中加入25μl1×SDS-PAGELoadingBuffer混合均匀，95℃加热5min。然后进行离心，500转离心1min，收集上清液，进行SDS-PAGE 检测。
非变性洗脱法：此方法洗脱的样品保持原有的生物活性，可用于后期功能分析。向离心管中加入5 倍柱体积的洗脱Buffer，用移液器吹打5 次，混匀，然后在室温下置于翻转混合仪或者手工轻轻翻转离心管，10min 后，离心，500 转离心1min，吸取上清液，收集洗脱组分，即为目标抗原，收集上清液新的离心管中，并立即加入十分之一体积的中和液，将洗脱组分pH 调节7.0-8.0，用于后期功能分析。
5 免疫沉淀间接法操作流程
免疫沉淀间接法操作流程示意图如下：

1)抗体与抗原混合：将抗体与含有目的蛋白的裂解液混合，室温震荡孵育30min-60min，或者2-8 度孵育过ye，取决于抗体与抗原的结合效率以及抗原的稳定性，需要自己优化结合条
件。形成抗原-抗体混合物。
注意：抗体的加入量要考虑到下面填料的量，抗体的加入量过多会影响到抗原-抗体混
合物与填料的结合。建议抗体加入量为填料80%的大载量。
2)填料准备：取适量的 rProtein A/G Beads 加入到2ml离心管中，500 转离心 1min，吸弃
上清。加入0.5ml 结合Buffer，悬浮填料（使填料处于与目的蛋白相同的缓冲体系下，起到
保护蛋白的作用），500 转离心1min，吸弃上清。再重复两次。
3)抗原-抗体混合物的吸附：将步骤2.5.1中得到的抗原-抗体混合物加入到处理好的填料中，
均匀，在室温下置于翻转混合仪或者手工轻轻翻转离心管，促使样品和填料充分接触并吸
附，约30min 后，约30min 后，500 转离心1min，收集上清液，留待检测。
4)洗杂：向上述离心管中加入0.5ml的洗杂Buffer，悬浮填料，进行清洗，去除非特异性吸
附的杂蛋白，500 转离心1min，吸弃上清。再重复两次。
5)抗原洗脱：提供以下两种抗原洗脱方案，可根据后期检测的需要选择不同的抗原洗脱方
法。
变性洗脱法： 此方法洗脱的样品适用于SDS-PAGE 检测。向离心管中加入
25μl1×SDS-PAGELoadingBuffer混合均匀，95℃加热5min。然后进行离心，200转离心
1min，收集上清液，进行SDS-PAGE 检测。
非变性洗脱法：此方法洗脱的样品保持原有的生物活性，可用于后期功能分析。向离心
管中加入5 倍柱体积的洗脱Buffer，用移液器吹打5 次，混匀，然后在室温下置于翻转混
合仪或者手工轻轻翻转离心管，10min 后，离心，500 转离心1min，吸取上清液，收集洗脱
组分，即为目标抗原，收集上清液新的离心管中，并立即加入十分之一体积的中和液，将
洗脱组分pH 调节7.0-8.0，用于后期功能分析。
填料清洗
rProtein A/G Beads 可以重复使用而无需再生，但随着一些变性物质的沉淀和蛋白的聚
集，往往造成流速和结合载量都下降，严重影响柱子的性能，这时需要对树脂进行清洗。
去除一些沉淀或变性物质 用2 倍柱体积的6M 盐酸胍溶液进行清洗，然后立即用5 倍柱体
积的PBS,pH7.4清洗。去除一些疏水性吸附造成的非特异性吸附物质 用3-4倍柱体积的
70%乙醇或2倍柱体积的1% TritonX-100清洗，然后然后立即用5倍柱体积的PBS,pH7.4
清洗。