α酮戊二酸脱氢酶(α-KGDH)活性检测试剂盒

产品名称:：  α酮戊二酸脱氢酶(α-KGDH)活性检测试剂盒

产品英文名:   αKetoglutarate Dehydrogenase(α-KGDH) Assay Kit

产品货号：BC0710            产地：北京市通州区马驹桥联东U谷8三楼

产品规格：50管/48样          产品商标：solarbio
保存与运输：4℃保存或-20℃保存；            参考价格：1300
库存状态：现货                          
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简要介绍：
α-KGDH（EC1.2.4.2）广泛存在于动物、植物微生物和培养细胞的线粒体中，是三羧酸循环调控关键酶之一，催化α-酮戊二酸氧化脱羧生成琥珀酰辅酶A。
    α-KGDH催化α-酮戊二酸、NAD+和辅酶A生成琥珀酰辅酶A、二氧化碳和NADH，NADH在340nm有特征吸收峰，以NADH的生成速率表示α-KGDH活性。

产品详细描述
产品内容：
试剂一：液体60mL×1瓶，4℃保存；
试剂二：液体0.6mL×1支，-20℃保存；
试剂三：液体55mL×1瓶，4℃保存；
试剂四：粉剂×1支，4℃保存；
试剂五：粉剂×1支，4℃保存；
试剂六：粉剂×1支，-20℃保存；
试剂七：粉剂×1支，-20℃保存；
试剂八：粉剂×1支，-20℃避光保存。临用前加入2mL双蒸水充分混匀待用，用不完的试剂仍-20℃保存。
工作液的配制：临用前把试剂四、试剂五、试剂六、试剂七转移到试剂三中混合溶解待用。

产品说明：
   α-KGDH（EC 1.2.4.2）广泛存在于动物、植物微生物和培养细胞的线粒体中，是三羧酸循环调控关键酶之一，催化α-酮戊二酸氧化脱羧生成琥珀酰辅酶A。
α-KGDH催化α-酮戊二酸、NAD⁺ 和辅酶A生成琥珀酰辅酶A、二氧化碳和 NADH，NADH在340 nm有特征吸收峰，以NADH的生成速率表示α-KGDH活性。

试验所需自备仪器和样品：
紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、α-KGDH的提取
称取约0.1g组织或收集约500万细胞，加入1mL试剂一和10uL试剂二，冰浴用匀浆器或研钵充分研磨，4 ℃ 11000 g离心10min，取上清，置冰上待测。
二、测定步骤
1. 分光光度计预热30min以上，调节波长到340 nm，蒸馏水调零
2. 空白管：
取1mL工作液加入1mL石英比色皿，37℃孵育5min后取出比色皿，再依次加入40μL试剂八和60μL蒸馏水，混匀并立即测量340nm处0s的吸光值A1，37℃准确反应2min，记录340nm处2min时的吸光值A2，计算ΔA空白=A2-A1。
3.测定管：
取1mL工作液加入1mL石英比色皿，在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）孵育5min后取出比色皿，再依次加入40μL试剂八和60μL样本，混匀并立即测量340nm处0s的吸光值A3，37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）中准确反应2min，记录340nm处2min时的吸光值A4，计算ΔA测定=A4-A3。
三、α-KGDH活性计算
1.按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟生成1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
 α-KGDH活性（U/mg prot）＝[(ΔA测定-ΔA空白)÷（ε×d）×V反总×10⁹]÷(Cpr×V样) ÷T
=1473.7×(ΔA测定-ΔA空白)÷Cpr
2.按样本鲜重计算
单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟生成1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
 α-KGDH（U/g 鲜重）＝[(ΔA测定-ΔA空白)÷（ε×d）×V反总×10⁹]÷(V样÷V样总×W)÷T
=1488.5×(ΔA测定-ΔA空白)÷W
3. 按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟生成1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
α-KGDH活性（U/10⁴cell）＝[(ΔA测定-ΔA空白)÷（ε×d）×V反总×10⁹]÷(V样÷V样总×500)  ÷T
=2.977×(ΔA测定-ΔA空白)
V反总：反应体系总体积，1.1×10^-3 L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.06mL；V样总：加入试剂一和试剂二体积，1.01mL；T：反应时间，2min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样品质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。
注意事项：
1、测定过程中所有试剂和样本在冰上放置，以免变性和失活。
2、比色皿中反应液的温度必须保持37℃或25℃，取小烧杯一只装入一定量的37℃或25℃蒸馏水，将此烧杯放入37℃或25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。
3、两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。
4、测定管的ΔA值在0.01-0.25之间，若测定管的ΔA值大于0.25，需将样本进行稀释。

相关文献：
《Inhibition of?α?ketoglutarate dehydrogenase activity afects adventitious root growth in?poplar via?changes in?GABA shunt》 作者:Jianyun?Yue,Changjian?Du,Jing?Ji,Tiantian?Xie, Wei?Chen,Ermei?Chang, Lanzhen?Chen, Zeping?Jiang,Shengqing?Shi
 期刊:Planta 影响因子:3.06 PMID:
《lncRNA Ftx promotes aerobic glycolysis and tumor progression through the PPARγ pathway in hepatocellular carcinoma》 作者:Xiao Li, Qi Zhao, Jianni Qi, Wenwen Wang ,Di Zhang ,Zhen Li, Chengyong Qin 期刊:International Journal of Oncology 影响因子:3.571 PMID:29845188
《Cell death induced by α-terthienyl via reactive oxygen species-mediated mitochondrial dysfunction and oxidative stress in the midgut of Aedes aegypti larvae》 作者:JieZhangaShakilAhmadaLan-YingWangaQianHanbJian-ChunZhangaYan-PingLuo 期刊:Free Radical Biology and Medicine 影响因子:5.657 PMID:31022448