线粒体呼吸链复合体Ⅱ活性检测试剂盒

产品名称:：  线粒体呼吸链复合体Ⅱ活性检测试剂盒

产品英文名:Mitochondrial Respiratory Chain ComplexⅡActivity Assay Kit

产品货号：BC3230           产地：北京市通州区马驹桥联东U谷8三楼

产品规格：50管/48样         产品商标：solarbio
保存与运输：4℃保存或-20℃保存；            参考价格：2200
库存状态：现货                          
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简要介绍：
线粒体复合体Ⅱ又称琥珀酸-辅酶Q 还原酶，广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，催化琥珀酸氧化生成延胡索酸，同时辅基FAD 还原为FADH2，后者进一步还原氧化型辅酶Q 生成还原型辅酶Q，是呼吸电子传递链的支路。
    复合体Ⅱ的催化产物还原型辅酶Q 可进一步还原2,6-二氯吲哚酚，2,6-二氯吲哚酚在605nm 有特征吸收峰，通过检测2,6-二氯吲哚酚的减少速率来计算该酶活性。

产品详细描述
产品内容：
提取液：液体45mL×1 瓶，4℃保存；
试剂一：液体40mL×1 瓶，4℃保存；
试剂二：粉剂×1 支，-20℃保存；溶于1mL丙tong，可分装后-20℃保存。临用前再用丙tong100倍稀释后使用。
试剂三：粉剂×1 支，4℃保存；临用前加入2mL丙tong溶解备用。
试剂四：液体2.5mL×1 瓶，4℃保存；
产品说明：
线粒体复合体Ⅱ又称琥珀酸-辅酶Q 还原酶，广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，催化琥珀酸氧化生成延胡索酸，同时辅基FAD 还原为FADH₂，后者进一步还原氧化型辅酶Q 生成还原型辅酶Q，是呼吸电子传递链的支路。
复合体Ⅱ的催化产物还原型辅酶Q 可进一步还原2,6-二氯吲哚酚，2,6-二氯吲哚酚在605nm 有特征吸收峰，通过检测2,6-二氯吲哚酚的减少速率来计算该酶活性。
试验中所需的仪器和试剂：
可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器、丙tong、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、复合体Ⅱ的提取： 

1. 称取约0.1g组织或收集500万细胞，加入1.0 mL提取液，用匀浆器或研钵于冰上匀浆。
2. 4 ℃ 600 g离心10min。
3. 将上清液移另一离心管中，4 ℃ 11000 g离心15min。
4. 上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅱ（此步可选做，可以判断线粒体提取效果）。
5. 在沉淀中加入400μL提取液，超声波破碎（功率20％，超声5秒，间隔10秒，重复15次），用于复合体Ⅱ酶活性测定，并且用于蛋白含量测定。

二、测定步骤：

1. 可见分光光度计预热30min 以上，调节波长605nm，蒸馏水调零。
2. 样本测定

1. 工作液的配制：临用前将试剂二和试剂三按1：1混合，现用现配；
2. 将试剂一37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）预热15min；
3. 在1mL玻璃比色皿中分别加入：

三、复合体Ⅱ活力单位的计算：  
（1） 按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每mg 组织蛋白每分钟消耗1 nmol 2,6-二氯吲哚酚定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅱ活力(U/mg prot)= [ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V 样×Cpr) ÷T= 476.2×ΔA÷Cpr
V 反总：反应体系总体积，10^-3 L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩尔消光系数，2.1×10⁴ L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.05mL；T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL。
注意事项：

1. 为保证实验结果的准确性，需先取1-2个样做预实验，如果测定的吸光值过高（高于1.5），可用蒸馏水稀释上清液后再测定。计算结果时注意乘以稀释倍数。若ΔA大于0.4，需将样本稀释适当倍数（计算公式中乘以相应稀释倍数）；若ΔA偏小，则可以通过增加加入的样品体积来提高灵敏度。
2. 样品蛋白浓度需自行测定，推荐我公司BCA蛋白浓度测定试剂盒。由于提取液中含有蛋白，所以在测定样品蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量。
3. 推荐使用样本蛋白浓度计算酶活，若用样本鲜重计算，则需加测胞浆提取物酶活，上清和沉淀酶活之和方为总酶活。
4. 本试剂盒试剂足够完成25管反应。
5. 附:使用样本重量计算公式：（样本检测数为25T/12S）

A、上清中复合体II活力的计算:
按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟消耗1 nmol 2,6-二氯吲哚酚定义为一个酶活力单位。
复合体II活性（U/g）= [ΔA1×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(W÷V提取×V样本)）÷T
                    =476.2×ΔA1÷W。
ΔA1：上清测定值；V 反总：反应体系总体积，10^-3 L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩尔消光系数，2.1×10⁴ L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V提取：加入提取液体积，1mL ；V 样：加入样本体积，0.05mL；T：反应时间，2 min；W：样本重量，g。
B、沉淀中复合体II活力的计算:
按样本鲜重计算：
单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟消耗1 nmol 2,6-二氯吲哚酚定义为一个酶活力单位。
复合体II活性（U/g）= [ΔA2×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(W÷V提取×V样本)）÷T
                    =190.5×ΔA2÷W。
ΔA2：沉淀测定值；V 反总：反应体系总体积，10^-3 L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩尔消光系数，2.1×10⁴ L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V提取：沉淀重悬体积，0.4mL ；V 样：加入样本体积，0.05mL；T：反应时间，2 min；W：样本重量，g。
C、样本复合体II总活力的计算:
样本复合体II总活力即为上清中复合体II活力与沉淀中复合体II活力之和。
按样本鲜重计算：
复合体II（U/g 鲜重）=476.2×ΔA1÷W +190.5×ΔA2÷W。

相关文献：
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