免疫印记套装的作用：实现目标蛋白的分子量分层

更新时间：2025-09-03

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免疫印记套装是用于执行免疫印记实验（WesternBlot，WB）的标准化试剂盒，其核心作用是通过“凝胶电泳分离蛋白质→转膜→抗体特异性结合→信号检测”的流程，实现对生物样本（如细胞、组织提取物）中特定目标蛋白质的定性鉴定、半定量分析及分子量验证，是分子生物学、免疫学、细胞生物学等领域研究蛋白质表达与修饰的核心工具。

免疫印记套装的作用：从“蛋白质分离”到“目标蛋白确认”的全流程支持

免疫印记实验的本质是“通过抗体的特异性结合，定位并检测复杂蛋白质混合物中的单一目标蛋白”，而WB套装通过整合实验所需的关键试剂、耗材（部分套装含工具），解决了“试剂单独采购、配比复杂、批次差异大”的问题，确保实验流程标准化、结果可重复。其具体作用可拆解为以下4个核心环节：

1.蛋白质分离：实现目标蛋白的分子量分层

套装中通常包含SDS-PAGE凝胶制备试剂（如SDS、丙烯酰胺、Tris-HCl缓冲液、过硫酸铵（APS）、四甲基乙二胺（TEMED）），作用是通过“十二烷基硫酸钠（SDS）变性蛋白质+聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）电泳”，根据蛋白质的分子量大小将复杂样本（如细胞裂解液中的上千种蛋白质）分离成不同的“蛋白条带”：

原理：SDS使蛋白质带负电，电泳时蛋白分子在凝胶中向正极移动，分子量小的蛋白移动速度快（跑在凝胶下方），分子量大的蛋白移动慢（跑在凝胶上方），最终实现“按分子量分层”，为后续“精准定位目标蛋白”奠定基础。

套装优势：预制凝胶（部分套装提供）可直接使用，无需手动配制（避免丙烯酰胺毒性暴露）；配套缓冲液（如电泳缓冲液）已预混，无需计算浓度，降低操作误差。

2.蛋白质转膜：将凝胶中的蛋白转移至固相膜

套装中包含转膜试剂（如转膜缓冲液、甲醇）和固相膜（硝酸纤维素膜NC膜或聚偏氟乙烯膜PVDF膜），作用是将凝胶中分离好的蛋白条带“转移”到固相膜上（此过程称为“转膜”）：

原理：利用“电转移法”（多数WB采用湿转或半干转），在电场作用下，凝胶中的蛋白质从凝胶内部迁移并吸附到固相膜表面，形成与凝胶中条带位置一致的“膜上蛋白条带”；固相膜的疏水特性可稳定结合蛋白质，便于后续抗体孵育。

套装优势：提供适配转膜方式的缓冲液（如湿转专用高离子强度缓冲液、半干转专用低电阻缓冲液），并搭配膜的预处理试剂（如PVDF膜需用甲醇激活），确保转膜效率（目标蛋白转移率＞80%）。

3.抗体结合：特异性识别目标蛋白

套装中包含封闭液（如5%脱脂牛奶、BSA溶液）、洗涤缓冲液（如TBST，含Tris-HCl、NaCl、Tween-20），部分套装还提供“内参抗体”（如β-actin、GAPDH抗体），作用是通过“封闭→一抗孵育→洗涤→二抗孵育→洗涤”的流程，让特异性抗体与膜上的目标蛋白结合：

封闭：用封闭液填充膜上未结合蛋白的“空白位点”，避免后续抗体“非特异性结合”（减少背景信号，避免假阳性）；

一抗孵育：一抗（针对目标蛋白的特异性抗体）与膜上的目标蛋白结合，实现“目标蛋白定位”；

二抗孵育：二抗（针对一抗的抗体，如抗兔IgG-HRP）与一抗结合，同时二抗偶联“信号标记物”（如辣根过氧化物酶HRP、碱性磷酸酶AP），为后续信号检测做准备；

洗涤：用TBST去除未结合的游离抗体，进一步降低背景干扰。

套装优势：封闭液、洗涤缓冲液均为即用型，无需自行配制；内参抗体可用于“校正上样量差异”（确保不同样本的蛋白上样量一致，半定量结果可靠）。

4.信号检测：可视化目标蛋白条带

套装中包含底物显色试剂（如HRP对应的ECL化学发光底物、AP对应的BCIP/NBT显色液），作用是通过“标记物-底物反应”产生可检测的信号，将膜上的目标蛋白条带“可视化”：

化学发光法（常用）：HRP催化ECL底物产生荧光信号，通过X光片曝光或化学发光成像仪捕捉信号，形成黑色条带（条带强度与目标蛋白含量正相关，可半定量）；

显色法：AP催化BCIP/NBT底物产生蓝紫色沉淀，直接在膜上形成可见条带（操作简单，适合定性分析）。

套装优势：底物试剂稳定性高（如ECL底物发光持续时间＞1小时），信号强度均匀，确保条带清晰、无拖尾，便于结果分析。