一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(FITC)说明书
货号：CA1040
规格：25T/50T
保存：-20℃保存，FITC-dUTP需避光保存。如果频繁使用（一周内），5×Reaction Buffer，FITC-dUTP和抗荧光淬灭封片剂可2-8℃保存。
产品简介：
一步法TUNEL细胞凋亡检测是一种高灵敏度又快速简便的细胞凋亡检测方法。对于经过固定和洗涤的细胞或组织，只要经过一步染色反应，洗涤后就可以通过荧光显微镜或流式细胞仪检测到凋亡细胞。细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。细胞凋亡时抽提DNA进行电泳检测，可以观察到180-200bp的DNA ladder。基因组DNA断裂时，暴露的3’-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase,TdT)的催化下加上荧光素(FITC)标记的dUTP(fluorescein-dUTP)，从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测，这就是TUNEL(TdT--mediated dUTP Nick-End Labeling)法检测细胞凋亡的原理。

本试剂盒有如下优点。

(1)高灵敏度：可以在单细胞水平检测到细胞凋亡，同时由于凋亡早期就有DNA断裂，可以检测到早期的细胞凋亡。

(2)特异性：TUNEL检测时通常更容易标记凋亡细胞，而不容易标记坏死细胞。

(3)快速：仅需约1-2个小时即可完成。

(4)方便：只需一步染色反应，洗涤后即可观察，不必使用二抗等进行多步操作。

(5)应用范围广：可以用于检测冷冻或石蜡切片中的细胞凋亡情况，也可以检测培养的贴壁细胞或悬浮细胞的凋亡情况。 TUNEL法特异性检测细胞凋亡时产生的DNA断裂，但不会检测出射线等诱导的DNA断裂(和细胞凋亡时的断裂方式不同)。这样一方面可以把凋亡和坏死区分开，另一方面也不会把射线等诱导发生DNA断裂的非凋亡细胞判断为凋亡细胞。 极少数细胞凋亡时没有DNA断裂，此时不适用TUNEL法检测。在个别类型的坏死细胞中也发现TUNEL检测呈阳性。在需要严格判断细胞凋亡的情况下，好同时检测多个凋亡指标。
产品内容：
试剂名称               包装            包装

TdT酶                  25μl           50μl

FITC-dUTP              25μl           50μl

5×Reaction Buffer     400μl          2×400μl

抗荧光淬灭封片剂       2.5ml           5ml

说明书                 1份             1份
注意事项：
用户需自备用于洗涤细胞的PBS或HBSS，用于固定的4%多聚甲醛，同时需自备含0.1% Triton X-100的PBS。如果用于石蜡切片的检测，需自备蛋白酶K，二甲苯。 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 操作步骤：

1. 对于贴壁细胞或细胞涂片：

a. PBS或HBSS洗涤一次。

b.如果细胞贴得不牢，可以干燥样品使细胞贴得更牢。
c.用4%多聚甲醛固定细胞30-60分钟。

d.用PBS或HBSS洗涤一次。

e.加入含0.1% Triton X-100的PBS，冰浴孵育2分钟。

f.转步骤5。

2. 对于悬浮细胞或细胞悬液：

a. 收集细胞(不超过2×106细胞)，PBS或HBSS洗涤一次。

b. 用4%多聚甲醛固定细胞30-60分钟。为防止细胞聚集成团，宜在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动的同时进行固定。

c. 用PBS或HBSS洗涤一次。

d. 用含0.1% Triton X-100的PBS重悬细胞，冰浴孵育2分钟。

e. 转步骤5。

3. 对于石蜡切片：

a. 二甲苯中脱蜡5-10分钟。换用新鲜的二甲苯，再脱蜡5-10分钟。无水乙醇5分钟。90%乙醇2分钟。70%乙醇2分钟，蒸馏水2分钟。

b. 滴加20μg/ml不含DNase的蛋白酶K，20-37℃作用15-30分钟(不同组织的佳作用温度和时间需自行摸索)。

c. PBS或HBSS洗涤3次。注意：这一步必须把蛋白酶K洗涤干净，否则会严重干扰后续的标记反应。

d. 转步骤5。

4. 对于冷冻切片：

a. 用4%多聚甲醛固定细胞30-60分钟。

b. PBS或HBSS洗涤2次，每次10分钟。

c. 加入含0.1% Triton X-100的PBS，冰浴孵育2分钟。

d. 转步骤5。 5. 配制TUNEL检测液： 参考下表配制适当量的TUNEL检测液，需充分混匀。注意：配制好的TUNEL检测液必须一次使用完毕，不能冻存。阴性对照不加TdT酶，其余相同。

                   1个样品           5个样品           10个样品

TdT酶                1μl            5μl               10μl

FITC-dUTP            1μl            5μl               10μl

5×Reaction Buffer   10μl           50μl              100μl

ddH2O                38μl           190μl             380μl

总体积               50μl           250μl            500μl

6. 对于贴壁细胞、细胞涂片或组织切片：

a. 用PBS或HBSS洗涤2次。

b. 在样品上加50μl TUNEL检测液，37℃避光孵育60分钟。注意：孵育时需注意在周围用浸足水的纸或药棉等保持湿润，以尽量减少TUNEL检测液的蒸发。或者置湿盒中。

c. PBS或HBSS洗涤3次。

d. 用抗荧光淬灭封片液封片后荧光显微镜下观察。可以使用的激发波长范围为450-500nm，发射波长范围为515-565nm(绿色荧光)。

7. 对于悬浮细胞或细胞悬液：

a. 用PBS或HBSS洗涤2次。

b. 加入50μl TUNEL检测液，37℃避光孵育30-60分钟。

c. PBS或HBSS洗涤2次。

d. 用250-500μl PBS或HBSS悬浮。

e. 此时可以用流式细胞仪进行检测或涂片后在荧光显微镜下观察。可以使用的激发波长范围为450-500nm，发射波长范围为515-565nm(绿色荧光)。

常见问题：

1. 出现非特异性荧光标记。

a. 有些细胞或组织，例如平滑肌细胞或组织，nuclease或polymerase的酶活性水平较高，易导致出现非特异性的荧光标记。解决方法是，取细胞或组织后立即固定并且要充分固定，以阻止这些酶导致假阳性。

b. 使用了不适当的固定液，例如一些酸性固定液，导致出现假阳性。建议采用推荐的固定液。

c. TUNEL检测反应时间过长，或TUNEL检测反应过程中反应液渗漏，细胞或组织表面不能保持湿润，也可能出现非特异性荧光。注意控制反应时间，并确保TUNEL检测反应液能很好地覆盖样品。

2. 荧光背景很高。

a. 支原体污染。请使用支原体染色检测试剂盒检测是否为支原体污染。 b. 高速分裂和增殖的细胞，有时也会出现细胞核中的DNA断裂。

c. TUNEL反应过强。可以用双蒸水稀释TdT酶2-5倍后再按照说明书操作。稀释后的TdT酶需当时使用。

d. 红细胞中血红蛋白导致的自发荧光产生严重干扰。此时宜选择其它细胞凋亡检测试剂盒。

3. 标记效率低。

a. 使用乙醇或甲醇固定会导致标记的效率较低。

b. 固定时间过长，导致交联程度过高。此时宜减少固定时间。

c. 荧光淬灭。Fluorescence在普通光照10分钟就会严重淬灭，解决方法是需注意避光操作。

d. 碘化丙啶双染时，如果碘化丙啶染色过深会导致观察到的本试剂盒的TUNEL染色效果减弱。碘化丙啶可以接受fluorescein激发产生的荧光，从而起到淬灭作用。解决方法是用较低浓度的碘化丙啶染色，例如0.5微克/毫升碘化丙啶。
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