选择合适的重组蛋白产品,对你得到正确的实验结果关重要,可从以下几点进行选择:
1、蛋白来源
对于一些蛋白,需要进行一系列的翻译后修饰才能成为具有活性的成熟蛋白。细菌不能提供这样的修饰,而哺乳动物细胞可以。因此,选购时应注意蛋白的来源。例如,novaprotein的人IL-4是在E. coli中制备的,金斯瑞的人IL-4是在哺乳动物CHO细胞中制备的。
当然除了上面提到的两种表达系统外,还有酵母和昆虫表达系统,四种系统各有优劣,选重组蛋白是一定要注意。
表达 | 细胞 | 优点 | 缺点 |
原核 | E.coli | 繁殖快、成本低、产量高;遗传背景及基因表达调控机制清楚;易于大规模培养,成本低廉 | 蛋白常为包涵体,纯化困难;无糖基化(分泌蛋白,细胞膜上蛋白不可用),生物活性不定;无翻译后修饰,内毒素含量高 |
酵母 | Pichia | 使用简单,表达量高,His-tag便于纯化,一定的翻译后加工可进行糖基化修饰,操作简单,适合大规模生产;可诱导表达,也可分泌表达,产物便于纯化 | 有时会出现蛋白切割问题;糖基化不能满足要求 |
昆虫 | High-5 | 产量高,翻译后加工与哺乳动物相似;对于部分有毒性或较难表达蛋白有优势;无内毒素污染 | 蛋白活性不如哺乳动物;适合表达激酶等定位于细胞内的真核蛋白 |
哺乳 | CHO; HEK293 | 完善的翻译后加工,活性接近天然蛋白 | 周期长、技术要求高;表达产量低 |
2、种属来源
蛋白的种属来源常见的有人源、小鼠源和大鼠源等。一般来说,不同种属之间的蛋白同源性在80%以上就可视为有交叉活性,可推荐使用。
3、生物活性和稳定性
蛋白的纯度、内毒素水平和批次间稳定性等直接会影响实验结果,因此,高品质的蛋白产品会严格监控这一环节,并且提供详细数据。同时,在选择蛋白产品时还需考虑其生物活性。
一般记得以下五点就行:
· 大多数人类细胞因子对小鼠细胞都有活性。
· 许多小鼠细胞因子对人类细胞也有活性,但比相应人类细胞因子活性低。
· 一些人类的细胞因子(如IL-7)在小鼠细胞中表现出比小鼠细胞因子更高的活性。
· 干扰素、GM-CSF、IL-3 和IL-4 有物种特异性,对于非人类细胞几乎没有活性。
· 成纤维细胞生长因子和神经营养因子是高度保守的,在其它的动物细胞中也能表现很好的活性。
4、蛋白形式
通常有两种形式:含牛血清白蛋白BSA或不含BSA,不含BSA一般用“CF"表示。加入BSA可以提高蛋白质的稳定性,增加了贮存期限。含BSA的蛋白可以作为细胞组织培养物或者ELISA实验中的理想标准品,而CF形式的蛋白尤其适用于活体实验。以R&D systems的Human IL?4为例,就有两种形式,买之前要先明确自己用来做什么实验的。
5、查阅文献
这个是快捷的方法,怎么去查文献是我们必须要掌握的技能。
虽有万般方法,但是只要你会查阅文献,则万事皆定。
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