线粒体提取试剂盒从细胞裂解到高纯度分离的全流程操作密码
一、试剂盒使用前准备
试剂与耗材检查
确认试剂盒组分完整（如裂解液、缓冲液、蛋白酶抑制剂、离心管、移液器吸头等），检查试剂有效期及储存条件（如4℃冷藏或-20℃冷冻）。
准备辅助设备：低温高速离心机（需预冷至4℃）、冰浴、恒温金属浴、细胞计数仪、微量移液器（量程覆盖0.5-1000μL）、无菌操作台。
预配溶液：按说明书稀释裂解液，加入蛋白酶抑制剂（如PMSF至终浓度1mM），避免蛋白降解。
细胞样本处理
细胞类型适配：哺乳动物细胞需胰酶消化后离心收集；组织样本（如肝脏、肌肉）需先用手术剪剪碎，再用组织匀浆器研磨。
细胞计数与活力检测：使用台盼蓝染色法确认细胞活力≥90%，避免死细胞释放的酶类干扰线粒体纯度。
二、线粒体提取试剂盒核心操作流程与规范
细胞裂解与线粒体释放
温和裂解：将细胞沉淀重悬于预冷的裂解缓冲液中，冰上孵育10-15分钟，期间轻柔吹打3-5次，避免剧烈振荡导致线粒体破碎。
差速离心分离：
第一步离心（低速）：1000-1500×g，4℃，5-10分钟，去除细胞核及未裂解细胞。
第二步离心（高速）：10,000-15,000×g，4℃，10-15分钟，沉淀线粒体，上清液为细胞质组分。
洗涤与重悬：用线粒体洗涤缓冲液（如含0.25M蔗糖的PBS）轻柔重悬线粒体沉淀，重复离心1-2次以去除杂质。
线粒体纯度验证与质量控制
形态学验证：透射电镜观察线粒体双层膜结构及嵴形态，确认无细胞碎片或细胞器污染。
功能验证：
呼吸链酶活性检测（如细胞色素c氧化酶活性），使用分光光度计监测550nm处吸光度变化。
线粒体膜电位检测（如JC-1染料法），荧光显微镜观察红色/绿色荧光比值，评估线粒体功能完整性。
蛋白定量：提取线粒体蛋白后，用BCA法测定浓度，通过特异性抗体检测线粒体标志蛋白，排除细胞质污染。
储存与稳定性
短期储存：线粒体悬液可置于冰上2-4小时，或4℃保存不超过24小时。
长期储存：分装后置于-80℃超低温冰箱，避免反复冻融导致活性丧失。添加10%甘油作为保护剂，可延长保存期限至6个月。
三、关键注意事项与安全防护
操作温度控制
全程在4℃冰浴或冷室中操作，避免线粒体酶活性因温度升高而降解。离心机需提前预冷至4℃，减少温度波动对线粒体的影响。
避免机械损伤
移液、混匀时使用宽口吸头或剪尖吸头，避免剪切力破坏线粒体结构。离心后轻柔倒出上清液，避免吸走沉淀。
污染防控
无菌操作：使用无菌试剂和耗材，在超净台内操作，防止细菌或真菌污染。
交叉污染防护：每步操作后更换吸头，避免样本间交叉污染。离心管需提前用75%乙醇擦拭消毒。
安全防护
操作人员需佩戴手套、口罩及护目镜，避免直接接触化学试剂（如裂解液中的去垢剂）。废弃物需按生物安全规范处理，如高压灭菌或化学消毒。
更新时间：2025-11-13
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