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更新时间：2025-11-06
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| 问01: | 实验中遇到TOP-10转化后无法长出菌落 |
| 答01: | 1、检测下感受态是否有问题：在不含有抗性的平板上做个空白验证；2、是否转化成功？可以用别的质粒试一下；3、42℃热激45s或是60s试一下 |
| 问02: | 高浓度时没有抗性作用，和预期的结果不相符。以前用的是上海生工的潮霉素，相同浓度值没有效果！ |
| 答02: | 不同厂家的抗生素效价有区别，我们用大肠杆菌做抑菌实验检测150ug/ml可以抑菌，低浓度没有抑菌效果。真菌的用量需要比细菌浓度高一些。（对于植物细胞，其有效浓度是20–200μg/ml；对于细菌，有效浓度是20–200μg/ml；对于真菌，有效浓度是200μg–1 mg/ml）。建议您增加一下用量。 |
| 问03: | C1100 DH5α感受态细胞 我们连接产物做转化涂板后不长斑，三个人做了不同的转化都是一样的结果 |
| 答03: | 1、确认下连接条件是否合适，要注意连接产物摇菌时不可以加含有抗生素的培养基；2、用质粒转化试一下是否也不长菌或是做个空白对照。 |
| 问04: | 你们公司几种感受态的区别？ |
| 答04: | 1、C1100 DH5菌株：克隆菌，用于分子克隆、质粒提取。可用于蓝白斑筛选。 2、C1200 TOP-10菌株：克隆菌，用于分子克隆，质粒提取。可用于蓝白斑筛选。该菌株适用于高效的DNA克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传。 3、C1300 JM109菌株：克隆菌，用于分子克隆。一种支持带有琥珀突变的载体生长的重组缺陷的抑制型菌株，对转染的DNA有修饰作用而无限制作用。 4、C1400 BL21(DE3)菌株：表达菌，可用于表达非毒性蛋白。该菌株用于高效表达克隆于含有T7噬菌体启动子的表达载体的基因。适合非毒性蛋白的表达。 5、C1500 BL21(DE3)pLysS菌株：表达菌，可表达毒性蛋白和非毒性蛋白。pLysS菌株含有pLysS质粒，因此具有氯霉素抗性。pLysS质粒含有表达T7溶菌酶的基因，能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰目的蛋白的表达。适合毒性蛋白和非毒性蛋白的表达。 |
| 问05: | 蓝白斑筛选，选的是蓝色的菌落还是白色的？ |
| 答05: | 在含有X-gal和IPTG的筛选培养基上，携带载体DNA的转化子为蓝色菌落，而携带插入片段的重组质粒转化子为白色菌落，平板如在37℃培养后放于冰箱3-4小时可使显色反应充分，蓝色菌落明显。 |
| 问06: | 常用抗生素推荐使用浓度？ |
| 答06: | 氨苄青霉素(Amp)：100ug/mL（细菌）；卡那霉素(kan)：10-50ug/mL（细菌）； 链霉素(str)：10-100ug/mL；利福平（Rif）：50-100ug/mL；庆大霉素：10-50ug/mL；两性霉素：0.25ug/mL |
| 问07: | 连接转化效率低？ |
| 答07: | 1、连接体系不合适；2、平末端不易连接，4°过夜，动作一定要轻柔；3、缩短热激时间，改为45s；4、检测酶是否合适（pfu扩增需单独加ployA尾巴） |
| 问08: | 转化后长出杂菌？ |
| 答08: | 如果是单菌落周围长出来卫星菌落，说明培养时间过长，菌株老化了，对后续实验影响不大，活化一下就好；如果是大小差不多的菌落，说明操作过程中污染了 |
| 问09: | 转化后只长出几个菌落？ |
| 答09: | 1、若果是转化的连接产物或是突变产物正常；若是质粒，则注意下是否操作有问题；2、有些质粒的确转化率低，可以换一种感受态试一下 |
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