活性氧检测试检测流程：从探针加载到信号输出
探针加载（细胞预处理）
步骤：
将细胞接种于培养板（如96孔板），待贴壁后更换无血清培养基（避免血清干扰）。
加入终浓度为5-20μM的探针（如DCFH-DA），37℃孵育20-30分钟。
关键点：
探针浓度需优化：过高导致背景噪声，过低降低灵敏度。
避光操作：荧光探针易被光淬灭，需用锡箔纸包裹培养板。
ROS诱导（刺激处理）
目的：人为提高细胞内ROS水平，模拟病理或应激状态。
常用刺激物：
氧化剂：H₂O₂（100-500μM）、叔丁基过氧化氢（t-BHP）。
药物：抗肿瘤药（阿霉素）、抗生素（庆大霉素）。
物理刺激：紫外线照射、高浓度葡萄糖（模拟糖尿病环境）。
处理时间：根据刺激物强度调整（如H₂O₂处理1-4小时）。
信号捕获（荧光检测）
方法：
流式细胞术：单细胞水平分析ROS分布，区分不同亚群（如活细胞、凋亡细胞）。
荧光显微镜：观察ROS在细胞内的定位（如线粒体、细胞核）。
多功能酶标仪：批量检测培养孔中整体荧光强度（适合高通量筛选）。
数据分析：
荧光强度与ROS水平呈正相关，需扣除空白对照（未加探针的细胞）和阴性对照（未刺激的细胞）。
质量控制与干扰排除
内源性干扰因素
细胞状态：死亡细胞释放内容物可能非特异性结合探针，需通过台盼蓝染色排除死细胞。
培养基成分：酚红（培养基pH指示剂）在绿色通道有自发荧光，需使用无酚红培养基或选择红色荧光探针（如DHE）。
探针稳定性
光淬灭：荧光探针易被光分解，检测前需严格避光，检测后立即读取数据。
氧化自反应：部分探针（如DCFH）在空气中可能缓慢氧化，需现用现配或分装冻存。
交叉反应验证
特异性测试：同时使用多种探针（如DCFH-DA+DHE）检测不同ROS，确认结果一致性。
抑制剂验证：加入ROS清除剂（如NAC、SOD）后，荧光信号应显著下降。
技术扩展：非荧光检测方法
化学发光法
原理：鲁米诺（Luminol）与H₂O₂在辣根过氧化物酶（HRP）催化下发光，光强与ROS水平相关。
优势：无需激发光，背景噪声低，适合检测低浓度ROS。
比色法
原理：ABTS（2,2'-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)）被ROS氧化为绿色产物，通过吸光度（650nm）定量。
应用：适用于组织匀浆或体液（如血液、尿液）中ROS的快速检测。
更新时间：2025-09-10
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