文献背景
富勒烯衍生物具有显著的抗肿瘤作用和广泛的安全性。羟基化富勒烯通过重塑肿瘤微环境（TME）抑制肿瘤生长和转移，包括抗氧化防御、免疫激活、血管生成破坏、消除癌症干细胞以及调节癌蛋白的表达和活性。乙二胺（EDA）修饰的[70]富勒烯（C70-EDA）可以靶向mRNA结合蛋白和mRNA转运相关蛋白进行转录后调控，激活自噬通量，诱导G0/G1细胞周期阻滞直接抑制癌细胞。但C70-EDA的分子结构尚不明确，使探索其抗肿瘤作用具有挑战性。
作者合成了三种[60]富勒烯两亲性衍生物：四[4-（氨基）哌啶-1-基]C60环氧化物（TAPC-4）、三[4-（氨基）哌啶-1-基]-氢-C60环氧化物（TAPC-3）和四[4-（羧基）哌啶-1-基）C60环氧化物（TCPC-4）。TAPC-4可通过G0/G1细胞周期阻滞直接抑制肿瘤细胞增殖，并通过抑制细胞迁移和逆转EMT来阻止肿瘤转移。与TAPC-4相比，TAPC-3具有高抑制作用，但其抗肿瘤效果较低。TAPC-4可结合热休克蛋白Hsp90β、波形蛋白和MYH9分别调节细胞周期、EMT和细胞迁移率。探索TAPC-4与Hsp90β、波形蛋白和MYH9的结合模式，进一步阐明TAPC-4的特殊抗肿瘤机制。
基本信息
摘要
恶性增殖和转移是癌细胞的特征。胺化[70]富勒烯具有显著的抗肿瘤作用，使其成为多靶向抗癌药物的候选药物。抗肿瘤胺化富勒烯的构效关系是一项迫切需要研究的课题。本文合成了三种分子结构明确的[60]富勒烯两亲性衍生物：TAPC-4、TAPC-3和TCPC-4。TAPC-4通过G0/G1细胞周期阻滞抑制多种肿瘤细胞增殖，逆转上皮细胞向间充质细胞的转变，消除肿瘤细胞的高迁移性。TAPC-4可从机体排出体外，对肿瘤增殖的体内抑制指数为75.5%，对转移性黑色素瘤的体内抑制指数为87.5%，安全裕度较大。分子动力学模拟表明，两亲性分子结构和末端氨基促进TAPC-4靶向热休克蛋白Hsp90β、波形蛋白和肌球蛋白重链9（MYH9），可能导致细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）的翻译、波形蛋白的表达和MYH9定位改变。这项工作强调了两亲性结构和末端氨基在胺化富勒烯抗肿瘤作用中的主导作用，为其抗肿瘤药物的开发奠定了基础。
研究结果与讨论
1.[60]富勒烯的两亲性衍生物体外抑制肿瘤增殖
采用一步法合成TCPC的叔丁氧羰基（Boc）和叔丁酯保护的TAPC-4和TAPC-3（图1a）。TAPC-3、TAPC-4和TCPC-4在水溶液中平均zeta电位分别为41.4、43.1和−40.1 mV（图1b）。TAPC-3、TAPC-4和TCPC-4的统计粒度分布分别为8.2±4.3、6.3±3.5和12.7±5.0 nm（图1c），两亲性富勒烯衍生物在水溶液中自组装形成纳米簇。PEG-PO涂层的TAPC-3和TAPC-4在各种癌细胞中的IC50约为10 μm，TCPC的IC50在20到90 μM之间（图1d，e）。L-02和HUVEC中TAPC-3和TAPC-4的IC50增加至约16 μM，表明其对正常细胞的抑制作用减弱。由于TAPC-4具有显著的抗肿瘤功效且产率远高于TAPC-3，因此选择TAPC-4进一步实验。
作者分别用TAPC-4（10μm）和PBS（NC）处理A549细胞24小时，共鉴定和定量6487种蛋白质。已获得具有最小p值的前几个GO项（图1f）。A549和DU145细胞与浓度高达10 μM的PEG-PO包被的TAPC-4孵育24小时，G0/G1期细胞的比例从50%提高到70%（图1g）。TAPC-4剂量依赖性地诱导Cyclin D1和磷酸化RB（pRB）的下调（图1h）。与细胞周期调节相关的差异蛋白上生成了蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络（图1i）。这些蛋白质中的大多数对细胞周期蛋白质的产生密切相关。TAPC-3和TAPC-4的抗肿瘤效果比TCPC-4更高。蛋白质组学分析表明TAPC-4通过下调Cyclin D1进而降低RB的磷酸化，使细胞周期停滞于G0/G1期，C70-EDA可诱导G0/G1期阻滞。TAPC分子结构清晰，具有良好的抗肿瘤活性，更适合于药物开发。
图1
2.TAPC-4抑制癌细胞迁移并诱导MET
高迁移率和EMT是癌症转移的标志。Transwell实验表明TAPC-3和TAPC-4可显著降低肿瘤细胞的迁移率（图2a）。TAPC-4增加了A549和DU145细胞中上皮标志物（E-钙粘蛋白）的表达，并降低了间充质标志物（波形蛋白、转录因子Snail、N-钙粘蛋白）mRNA的表达水平（图2b）。TAPC-4剂量依赖性地降低A549和DU145细胞中波形蛋白和N-钙粘蛋白的蛋白表达，如Western（图2c）和免疫荧光（图2d）所示。因此，TAPC-4促进了间充质上皮转化（MET），这是EMT的逆转过程。一种原癌基因蛋白Myc被显著下调，其调节波形蛋白的表达以及EMT诱导和细胞迁移的相关途径。波形蛋白的下调通过反馈来降低转录因子Snail的mRNA和蛋白表达。转录因子Snail通过抑制E-钙粘蛋白的表达来调节EMT，减少细胞连接，增加细胞迁移。
图2
3.TAPC-4靶向特异性肿瘤调节剂
TAPC-4标记了D-生物素得到了两个产率相当的生物素化TAPC-4异构体，图中为热力学稳定性相对较高的一种（图3a）。Hsp90β，波形蛋白和MYH9可能是TAPC-4抑制肿瘤的靶点（图3c），其在1-3带MS评分最高，在肿瘤细胞增殖、迁移和EMT过程中起关键作用。TAPC-4与Hsp90、波形蛋白和MYH9的特异性结合相互作用通过免疫沉淀实验验证（图3d）。TAPC-4诱导Cyclin D1表达下调和随后的G0/G1细胞周期停滞（图1h），表明TAPC-4与Hsp90的特异性相互作用可能通过PI3K/AKT途径抑制Cyclin D1的翻译。TAPC-4可能通过蛋白水解途径结合波形蛋白并下调波形蛋白表达（图2b-d）。TAPC-4与MYH9的结合并没有改变其蛋白表达（图3e），而是使MYH7从细胞质运输到细胞边缘，从而消除了肿瘤细胞的流动性（图3f）。
TAPC-4和TCPC-4与Hsp90β的疏水基团结合主要是由于富勒烯碳笼和疏水基团间的疏水相互作用（图3g）。TAPC-4的氨基与HSP90的亲水残基形成多个氢键和静电相互作用，促进TAPC-4获得比TCPC-4更多的负静电能，增强与Hsp90β的结合（图3h）。两亲性TAPC-4和TCPC-4都能与Hsp90β，波形蛋白和MYH9通过富勒烯碳笼与蛋白质的疏水相互作用结合，TAPC-4的末端氨基酸部分可以与亲水性氨基酸残基形成固体静电相互作用以增强其与靶蛋白的结合。因此，两亲性分子结构和末端氨基使TAPC-4能够与Hsp90β，波形蛋白和MYH9结合，这可能使其在体外具有高抗肿瘤功效。
图3
4.TAPC-4在体内的分布和排泄
BALB/c小鼠分别经腹腔注射Cy5.5和Cy5.5标记的TAPC-4（TAPC-Cy5.5）。取小鼠的主要脏器（心、肝、脾、肺、肾）在不同时间间隔（1.5~96h为短期，30d为长期）进行体外成像。游离Cy5.5积累在6小时达到最大值，大部分在96小时内被快速排泄。TAPC-Cy5.5的荧光强度在6小时左右达到非常高的水平，随后逐渐下降，30天后基本消失，表明TAPC-4可以被排出体外。TAPC-Cy5.5和游离Cy5.5主要分布在肝、肾、肺和脾。与Cy5.5在72 h内被快速清除相比，TAPC-Cy5.5在30 h内在肾、肺和脾中重新分布，并缓慢排出，72 h时只有少量排出，30 d后大部分排出。有报道称水溶性富勒烯衍生物在肝、脾、肺和肾中积累，一个月后可从体内清除，这与TAPC-4的分布和排泄一致。总之，TAPC-4主要分布在肝、脾、肺和肾中，并在几天后排出，避免了长期毒性。
图4
5.TAPC-4抑制体内肿瘤生长
在治疗中未观察到体重和主要脏器（心、肝、脾、肺和肾）重量的显著变化，表明PEG-PO修饰后TAPC-4具有较高的生物相容性（图5b）。PEG-PO在最大剂量下也不会引起肿瘤体积和肿瘤重量的变化，因此其对肿瘤生长的抑制作用可忽略不计（图5c，d）。TAPC-4对肿瘤组织的收缩呈剂量依赖性，高剂量时对肿瘤体积变化的抑制指数达到75.5%。肿瘤切片的TUNEL和H&E染色显示TAPC-4诱导肿瘤广泛坏死（图5e）。主要脏器（心、肝、脾、肺和肾）的H&E染色切片未见组织学损伤，表明TAPC-4在体内有效剂量下具有较高的安全性。荷瘤小鼠体内显著升高的白细胞数量在TAPC-4治疗后下降到正常范围。TAPC-4降低了Cyclin D1的蛋白水平，消除了肿瘤组织中RB的磷酸化，表明TAPC-4可以诱导G0/G1细胞周期阻滞，抑制体内肿瘤增殖。肿瘤组织中E-钙粘蛋白上调、波形蛋白和N-钙粘蛋白下调（图5f），表明EMT通过TAPC-4被逆转。因此，安全范围内的TAPC-4可在体内外通过阻断G0/G1期获得显著的抗肿瘤作用。
图5
6.TAPC-4抑制体内肿瘤转移
B16-F10-Luc细胞静脉植入BALB/c小鼠中诱导肺转移性黑色素瘤。每隔一天向小鼠静脉注射100 μL生理盐水、PEG-PO和PEG-PO包被的TAPC-4（图6a）。在对照组中观察到强烈荧光和大量肺转移结节，表明转移率相对较高（图6b-d）。TAPC-4治疗时，黑色素瘤的发光强度下降，具有良好的治疗效果（图6c）。TAPC-4使肺转移结节的平均数量从40个减少到5个，抑制指数达到了87.5%（图6e）。给药24小时后，TAPC-4在肺、脾和肝中富集（图6f），小鼠体重未下降，表明TAPC-4具有良好的生物相容性。因此，TAPC-4在体内外通过逆转EMT对肿瘤转移具有显著的抗肿瘤作用。
图6
结论
为探索抗肿瘤胺化富勒烯的构效关系合成三个[60]富勒烯的衍生物，TAPC-4可下调Cyclin D1的表达，抑制RB磷酸化，阻断G0/G1细胞周期，从而抑制肿瘤细胞增殖。氨基基团较少的TAPC-3具有同样高的抗肿瘤作用。具有相同分子构型但末端氨基被羧基取代的TCPC-4抗肿瘤作用较低。TAPC-4在体内对肿瘤生长的抑制指数为75.5%，对原发器官无组织损伤，具有较高的抗肿瘤疗效和生物安全性。TAPC-4可抑制肿瘤细胞的流动性和EMT增加，对肺转移性黑色素瘤的抑制指数达到87.5%。肿瘤特异性Hsp90β、波形蛋白和MYH9被筛选为TAPC-4的靶点。两亲性分子结构和末端氨基促进了TAPC-4与Hsp90β、波形蛋白和MYH9的结合，可能分别抑制了Cyclin D1的翻译和抑制细胞的G0/G1期阻滞，波形蛋白表达下调逆转EMT和通过MYH9的亚细胞运输来抑制细胞迁移。因此，胺化富勒烯的抗肿瘤作用由两亲性结构和末端氨基共同主导，这为多靶向抗肿瘤药物开发提供了基本见解和新策略。
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