活性氧检测试剂盒的使用说明
更新时间：2021-01-18
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活性氧包括超氧自由基、过氧化氢及其下游产物过氧化物和羟化物等，参与细胞生长增殖、发育分化、衰老和凋亡以及许多生理和病理过程。活性氧检测试剂盒是一种利用荧光探针DCFH-DA进行活性氧检测的试剂盒。DCFHDA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。故而检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。活性氧检测试剂盒的使用如下：
（1）装载探针：对于刺激时间较短(通常为2小时以内)的细胞，先装载探针，后用活性氧阳性对照或自己感兴趣的药物刺激细胞。对于细胞刺激时间较长(通常为6小时以上)的细胞，先用活性氧阳性对照或自己感兴趣的药物刺激细胞，后装载探针。
（2）原位装载探针
（3）收集细胞后装载探针：按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10μM。细胞收集后悬浮于稀释好的DCFH-DA中，细胞浓度为一百万至二千万1×106～2×107/mL，37℃细胞培养箱内孵育20分钟。每隔3-5分钟颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。
（4）加药刺激：直接用活性氧阳性对照或自己感兴趣的药物刺激细胞，或把细胞等分成若干份后刺激细胞。
（5）检测：对于原位装载探针的样品可以用激光共聚焦显微镜直接观察，或收集细胞后用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。
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