在组织细胞的体外培养和原代细胞培养中的组织细胞分散(将组织块制备成单个细胞悬液)和传代细胞培 养中,贴壁生长细胞的消化分散均要使用组织细胞消化液.胰蛋白酶消化液一共有三种,分为胰蛋白酶- EDTA消化液(不含酚红);胰蛋白酶-EDTA消化液(含酚红);胰蛋白酶消化液(不含酚红),可根据客户的需要 来选择.
其中,胰蛋白酶含量为0.25%(2.5g/L),EDTA含量为0.02%(0.2g/L).PBS为常用的不含钙镁的细胞培养用 PBS.经无菌过滤,可直接使用.
胰蛋白酶消化液对细胞的分离效果与细胞的类型、特性和瓶壁表面特性有关.一般来说浓度大、温度高( 勿高于37℃)、作用时间长,则对细胞分离能力大.但超过一定程度会损伤细胞,导致细胞传代后不能贴壁 或死亡.胰酶在pH 8.0、37℃时消化能力强.溶液中的Ca2+、Mg2+和血清会降低胰酶活力,所以配制胰酶 时须用无Ca2+、Mg2+的D-Hanks液.当消化结束时,可加入少量血清或含血清的培养基以终止胰酶作用.
细胞传代使用的胰酶浓度是0.25%或0.2%.用于原代细胞培养消化组织块则为0.1%或0.125%.
贴壁细胞:
在培养瓶中长成致密单层后,继续生长的空间不足,培养基中的营养成份也消耗较多,同时代谢废物也有较 多堆积,需要分瓶培养,扩增、传代.对于悬浮生长细胞和贴壁不太紧的细胞如SP2/0,293等,可直接吹散后 分瓶;而对于贴壁较紧的细胞如Hela,HepG2,CHO等,则需要以细胞消化液消化后,才能脱落和分散,扩瓶.一 般操作过程为(以下操作均必须严格按无菌操作的要求进行):
将长成致密单层细胞的细胞瓶中原来的培养液弃去;
加入胰蛋白酶-EDTA溶液,视细胞瓶的大小加入体积为2ml或更多(依培养器皿的大小而定),以使充分浸 润;
一般消化时间约为13分钟,肉眼观察瓶底由半透明(细胞单层连接成片)转为透明、点状(出现细小空 隙)时,弃去细胞消化液,并加入适量的*培养液终止消化,吹打分散;
视实验目的,分入多瓶继续培养,一般比例为一传二到一传四;或接种与微孔板中.
胰蛋白酶消化液组织的消化:不同的组织需要消化的时间相差很大,通常以消化后可以充分打散组织为宜.
