淋巴细胞分离液为Ficoll、羟乙基淀粉550与泛影酸葡甲胺的混合液。抗凝外周血可在分离液中分层。离心时,在Ficoll、羟乙基淀粉的作用下红细胞与粒细胞聚集并迅速沉降;此时,淋巴细胞及其他单个核细胞仍处于分离液上层,红细胞污染可忽略不计。大部分血小板可在细胞清洗低速离心过程中去除。 其他人及动物多种比重细胞分离液,因不同种属不同比重分离液的细胞离散系数及细胞带电不同,用户在制定分离液时应提供所需分离液的比重、动物种属及被分离细胞的名称。
1. 轻轻颠倒瓶子使LSM充分混合
2. 无菌转移3 mlLSM到15 ml离心管中。
3. 混合2 ml除纤维蛋白血液或肝素处理血液 和2 ml 生理盐水。
4. 仔细的将稀释血液加入3 mlLSM(室温)于15ml离心管中,在血液和LSM中形成一个明显的分层。不要将稀释血液混合入LSM中。
5. 室温下400g离心15-30分钟,离心可以沉淀红细胞和多核白细胞同时可以再LSM上形成一层单核淋巴细胞,如上图所示。
6. 吸出淋巴细胞上方2-3mm的血浆。
7. 吸取淋巴细胞层以及它下面一半的LSM和转移到另外的一个离心管。加入等体积的平衡盐缓冲液淋巴细胞离心管中,室温离心10分钟,离心速度设定在既不损伤细胞又能沉淀细胞即刻,例如160 - 260 x g(去除LSM和降低血小板的百分比)。
8. 用平衡盐缓冲液清洗细胞,用适当的培养基重悬细胞。